组织化学染色及免疫荧光染色：将新鲜猪结肠组织及脱细胞结肠组织用PBS 漂洗10 次，剪成约1 cm×1 cm 大小，用滤纸把水分稍吸干，用OCT 进行包埋，液氮速冻，冰冻切片机切片，切片厚度为2 0 μm。①苏木精-伊红染色：用PBS清洗玻片上的OCT，用预冷的丙酮浸泡玻片固定10 min，苏木精染色3 min，盐酸乙醇返蓝5 s，流水冲洗5 min，伊红染色1 min，取出后流水冲洗5 min，乙醇梯度脱水、二甲苯透明切片后通风橱风干，中性树脂封固；②DAPI 染色：用PBS 清洗玻片上的OCT，滴加0.2%Triton 通透15 min，PBS 洗3 遍，用DAPI 避光封固。

扫描电镜观察：将新鲜结肠组织及脱细胞结肠组织剪成约5 mm×5 mm 正方形片状，用2.5%戊二醛于4 ℃下避光固定过夜，将组织用PBS 浸泡清洗3 次，每次10 min，分别用体积分数50%，70%，90%乙醇浸泡脱水各1 次，每次10 min；用无水乙醇浸泡脱水3 次，每次10 min，将脱水后的组织放入临界点干燥仪脱水，喷金，用扫描电子显微镜观察支架黏膜层超微结构。

1.4.3 实验分组 人结肠HCT116 细胞复苏后经胰酶消化成单细胞悬液，细胞浓度约为5×107L-1。将细胞悬液滴在细胞爬片上，待镜下观察到细胞贴壁形态，生长至密度约为70%时取出固定。①三维培养：将脱细胞猪结肠支架剪成约1 cm×1 cm 大小块状，体积分数75%乙醇浸泡过夜，随后用无菌PBS 浸泡清洗3 次，用完全培养基浸泡4 h，用无菌滤纸将黏膜层培养基尽量吸干，黏膜层向上，将细胞浓度为2×1010L-1的单细胞悬液滴在黏膜层表面，使之保持湿润，放入孵箱培养两三小时，取出后沿孔壁小心加入完全培养基培养；②二维培养：取细胞爬片放入12 孔板，将人结肠HCT116 单细胞悬液滴在细胞爬片上，再沿孔壁小心加入完全培养基，待培养基没过爬片放入孵箱培养。

1.4.4 活-死染色观察细胞生长情况 三维培养1，3，7 d后取出脱细胞猪结肠支架，PBS 轻轻漂洗1 次，避光室温下在黏膜层滴上100 μL 活死染色工作液，避光放置5-10 min，荧光显微镜下观察细胞在支架上的黏附、生长情况。

1.4.5 鬼笔环肽染色观察细胞形态 二维及三维培养7 d 后，用鬼笔环肽工作液进行细胞骨架染色，通过荧光显微镜观察HCT116 细胞的生长情况和形态表现。染色方法：用多聚甲醛固定支架过夜；PBS 洗3 遍，每次5 min；0.2%Triton 透膜10 min；PBS 洗3 遍，每次5 min；加鬼笔环肽工作液(1.5 ∶1 000)避光染色30 min；PBS 洗3 遍，每次5 min；加DAPI，避光保存。

1.4.6 支架标本的切片染色 三维培养7 d 后取出支架，用PBS 轻微清洗1 次，用滤纸把水分稍吸干，包埋，液氮速冻后进行冰冻切片，用预冷的丙酮浸泡玻片固定，分别进行苏木精-伊红染色与免疫荧光染色。

1.5 主要观察指标 ①猪结肠脱细胞前后组织内细胞核残留情况；②猪结肠脱细胞前后黏膜层的超微结构；③HCT116细胞在脱细胞猪结肠支架上的生长、增殖情况；④HCT116细胞在二维及三维培养模式下的生长形态。

2 结果 Results

2.1 脱细胞猪结肠支架的鉴定 大体观察正常猪结肠组织的黏膜层呈淡粉色，浆膜层呈淡白色，见图1A、B；经过脱细胞处理后黏膜层明显瘫软，呈半透明白色，见图1C、D，组织体积大小在脱细胞处理前后的改变不大。

苏木精-伊红染色显示，新鲜猪结肠的肠壁结构分层清晰，黏膜层含有丰富的上皮细胞，黏膜下层结构疏松，有少量细胞分散分布，肌层则由大量平滑肌细胞构成，浆膜层的结缔组织较为致密，见图2A、C；经过脱细胞处理后，肠上皮细胞被完全清除，但细胞外基质成分完整保留，肠壁的4层结构排列完整，见图2B、D。

扫描电镜显示，猪结肠黏膜层表面较新鲜脱细胞猪结肠更为致密，肠隐窝结构保存完整，且在表面形成大小、分布均匀的多孔结构，孔隙的形状规则偏圆，内径大小范围在40-60 μm，见图3，孔隙大小符合细胞的种植、生长。

2.2 三维培养模式下人结肠HCT116 细胞的生长与增殖HCT116 细胞在脱细胞猪结肠支架上培养7 d，活-死染色结显示，培养第1 天时，细胞能很好地聚集在支架黏膜层的孔隙内，且无太多死细胞，见图4A；培养至第3 天时，细胞逐渐向孔隙外蔓延生长，小部分细胞已生长连接成片，未看到死细胞，见图4B；培养至第7 天时，细胞生长密度进一步增大，在黏膜层表面生长成片，未见到死细胞，且无细胞脱落的情况，见图4C。随着培养时间的延长，细胞能从脱细胞猪结肠隐窝中逐渐增殖，平铺在黏膜表层并逐渐蔓延生长成片，由于支架的大小固定，培养超过7 d 后易产生细胞成片脱落，这一生长与细胞在培养皿上的二维培养相似，细胞会产生接触抑制。

文章来源：《肿瘤药学》 网址: http://www.zlyxzz.cn/qikandaodu/2021/0222/666.html