三维培养第7 天时苏木精-伊红染色及免疫荧光染色可见，部分HCT116 细胞可在脱细胞猪结肠支架孔隙内生长成团，并有部分细胞沿着孔隙继续向黏膜下层生长，见图4D、E。这种纵向生长的趋势与肠癌细胞入侵黏膜层并向下侵犯肌层、浆膜层类似，符合侵袭性生长的特点。

2.3 二维及三维培养模式下人结肠HCT116 的形态学特点 二维培养模式下，HCT116 细胞表现为短梭形片状，且无重叠生长表现；三维培养模式下，HCT116 细胞聚集在脱细胞猪结肠支架孔隙中，表现为成团聚集生长，聚集的HCT116 细胞表现得较为圆润(黄色箭头)，然而团聚生长细胞群的边缘细胞则表现为纺锤形(白色箭头)，表现为向周边生长增殖、侵袭的趋势，见图5。

3 讨论 Discussion

此次实验介绍了一种以制备脱细胞猪结肠支架为基础，并提供肠癌细胞体外三维培养体系的一种可行性方案。目前最有效的脱细胞方法是联合物理、化学及酶的方法[15-17]，先用物理方法或者化学去垢剂破坏细胞膜，然后用酶将细胞组分与细胞外基质分离开，最后用搅拌、振荡等物理方法提高脱细胞效率，最终达到既能保留较为完整的细胞外基质又能保持其天然机械性能和生物性能的目标。与肾脏、肝脏等实质脏器不同，结肠组织为空腔器官且管壁很薄，所以使用洗涤剂SDS、Triton 和EDTA 反复振荡洗涤组织进行脱细胞，选择了较为温和的方法进行脱细胞处理，在时间与洗涤溶液浓度配制上也进行了多次调整，最终得到既能完全脱细胞又能保留其基本组织结构的支架。

部分脱细胞支架能提供天然的细胞龛洞[9]，经扫描电镜观察到脱细胞后的支架孔隙大小符合细胞黏附于支架的理想数值[18]，有利于细胞的附着与富集，为下一步利用该支架培养细胞进行体外实验的可行性提供了证据。另一方面，猪与人的细胞外基质蛋白高度保守，猪结肠的基质适用于模拟人结肠。与动物实验相比，脱细胞支架不仅能为细胞提供与正常组织器官相同的空间框架，伦理上又能减少实验动物的牺牲，经济上节约成本，减少了培养周期，能更快地建立起三维培养模型。MAZZA 等[19]通过人肝脏脱细胞支架建立了不同细胞在该支架上生长的模型，发现与标准二维细胞培养相比，在支架中生长的实质型和非实质型肝细胞表现出明显不同的基因表达，且人原代肝细胞能在该支架的动态生长条件下保持基本代谢功能和蛋白质合成。越来越多的研究者倾向于使用三维培养体系来进行肿瘤的转移、耐药等方面的研究[20-23]，表明脱细胞结肠支架也具有用作肿瘤转移、耐药方向研究的前景。

已经有相关研究建立了脱细胞羊结肠支架并鉴定了基本表征[24]，或通过建立人结肠脱细胞支架在结肠基质重新种植携带突变基因的肠上皮细胞，证明了脱细胞支架用于肠癌研究的潜力[25]。脱细胞结肠作为细胞培养的载体具有诸多优势，能够提供天然的细胞外基质[26-27]。鉴于结肠恶性肿瘤发展的特殊性，大家忽略了肠癌进展中的关键一步——跨越基底膜的浸润侵袭，这一过程提示了肿瘤转移的开始，也提示了肿瘤患者基本失去了痊愈的机会。但是人工合成的支架很难模拟这一结构，现今大部分三维培养模型大多分为基于支架和无支架2 种，包括三维肿瘤球体培养[28-29]、人工合成三维仿生支架等[30-33]，这些模型很难模仿原位肠癌从结肠黏膜向下侵袭的表现。目前大部分脱细胞支架培养是利用肿瘤组织进行脱细胞处理后进行细胞再种植，可是原部位组织形态结构早已被破坏，不能再模拟还原出早期肿瘤发生发展的生物学行为[33]。此次实验直接利用支架本身黏膜层具有的孔隙结构种植肠癌细胞，与普通的动物模型和二维培养模型相比，此次研究建立了更简单经济的培养模型，满足了三维肿瘤模型的最低要求，并通过实验证明该支架能模拟早期肠癌细胞向黏膜下层浸润转移的生物学行为。

研究表明，细胞形态和运动能力的改变与肿瘤的转移相关，而三维培养往往能诱导肿瘤细胞表现出更强的转移侵袭能力[34-35]。HCT116 细胞是一种上皮来源的低分化结肠恶性肿瘤细胞，二维培养条件下的HCT116 细胞表现为短梭片状，而三维支架上的HC116 细胞的形态变圆，聚集在孔隙中生长，孔隙外的边缘细胞呈纺锤形，表明在同一支架的不同的结构平面上细胞的生长形态是不同的，这种物理支撑结构发生改变与细胞的形态改变密切相关。

综上所述，实验介绍了一种制备猪结肠脱细胞支架的方案，且验证了这种支架体外培养HCT116 细胞的可行性。利用该方法进行脱细胞处理可彻底地清除支架内的细胞，HCT116 细胞在脱细胞支架上能很好地生长、增殖。不同于普通平面培养和人造三维支架培养模型，该支架提供了与结肠组织相似的细胞外基质，有助于研究肿瘤微环境中细胞外基质与肠癌相互作用等研究。同时，肠黏膜表面保留了适合细胞黏附的天然孔隙，细胞可在孔隙内进行增殖，甚至模拟原位结肠恶性肿瘤向肠黏膜下层浸润侵袭，进而突破基底层的这一过程，对于模拟肠腔内生长的原位浸润癌能提供一定的研究价值，这是其他肠癌生长体外三维模型难以实现的。HCT116 细胞作为一种低分化结肠癌细胞具有较强的转移、侵袭能力，观察其在脱细胞肠黏膜层的生长形态表现较平面上更为圆润，更符合上皮细胞形态学特点，能聚集在孔隙中成团生长，向黏膜下层生长，而细胞团周围的细胞表现更倾向于间充质细胞的模样，能获得更强的转移、侵袭能力。

文章来源：《肿瘤药学》 网址: http://www.zlyxzz.cn/qikandaodu/2021/0222/666.html