威尔逊氏病（Wilson's disease, WD）作为单基因肝病是基于ATP7B基因的突变而产生的，并导致肝脏中铜（Cu）排泄的功能恶化。过量的铜积累在各种器官，例如肝脏和大脑。威尔逊氏病患者表现出临床异质性，涵盖了从急性或慢性肝衰竭到神经系统症状。通过锌或螯合剂的终生治疗可以改善病程，但是在相当一部分患者中观察到严重的副作用，例如神经功能恶化和肾毒性，因此肝移植将是不可避免的。另一种治疗方案则是ATP7B基因的基因校正。在这项研究中，研究人员使用CRISPR/Cas9基因编辑在人类细胞系中引入人工ATP7B点突变，并通过额外使用的单链寡核苷酸（ssODNs）来纠正这一突变，模拟威尔逊氏病点突变在体外的基因修正。

图一：ATP7B基因敲除突变体的生成

CRISPR/Cas9介导的ATP7B-KO细胞产生了铜电阻降低。用HEK239T细胞建立敲除模型并用PX459脂质体转染。用MTT法测定HEK293T细胞和KO突变体（图1A）的细胞代谢活性。Sanger测序证实HEK293T细胞克隆#1在1184位置（黑色框内标记）缺失一个胞嘧啶核苷酸，且PAM区域上游有三个核苷酸（红色框内标记）。

图2：CRISPR/Cas9介导的ATP7B修复方案

ATP7B敲除细胞（HEK293TΔC）表现为胞嘧啶核苷酸缺失（红色“-”标记）的点突变。Cas9在PAM区域（标蓝）上游切断三个核苷酸（红色箭头标记）。修复ssODN在位置1、2和3（ssODN_3M）或位置2和3（ssODN_2M）包含沉默阻断突变。

图3：CRISPR/Cas9介导的ATP7B修复方案

用pmaxGFP脂质转染HEK293TΔC细胞。GFP表达水平显示在图3A中。对携带阻断突变2号（虚线框）的ATP7B修复的纯合HEK293TΔC细胞克隆（黑色框）（图3B）和携带所有三个阻断突变（虚线框）的ATP7B修复的杂合HEK293TΔC细胞克隆（黑色框）（图3C）进行Sanger序列分析。这些实验数据证明了CRISPR/Cas9介导的ATP7B点突变校正是可行的，并且有发展临床使用的可能。

结直肠癌是第三大常见癌症。CRC与Wnt/β-catenin（β-连环蛋白）信号传导通路的失调密切相关。β-catenin在Ser45被酪蛋白激酶1（CK1）磷酸化，并连续在Ser33，Ser37和Thr41被糖原合酶激酶-3β（GSK-3β）磷酸化，从而引起随后的泛素化和蛋白酶体降解。这些Ser/Thr残基的突变会改变重要的功能性磷酸化位点，抑制β-catenin磷酸化降解级联反应，并导致Wnt/β-catenin信号通路的组成性激活。因此，通过基因编辑技术校正β-catenin基因突变可以开发用于结肠癌的新一代治疗方法。

在该研究中，人结肠直肠细胞系HCT-116被选用，因为它具有β-catenin基因的杂合缺失突变（ΔTCT），其负责在蛋白质的N-末端区域编码调节性Ser45。研究人员通过基因测序证实了ΔTCTSer45缺失突变在β-连环蛋白基因的外显子3和CRISPR/Cas9 PAM位点上的位置。96 nt ssODN包含了作为HDR修复模板的野生型β-catenin基因序列。将HCT-116细胞与载体和ssODN共转染后，通过FACS筛选GFP阳性细胞并扩增，并通过TA克隆和测序计算突变校正效率。

图1：HCT-116细胞中β-cateninΔTCTser45的突变校正

由于该基因的一个等位基因中的缺失突变，HCT-116细胞中β-catenin的测序图谱显示从突变基因座开始的重叠峰（图1C）。突变校正后，我们发现突变基因座中存在TCT序列，因此从突变基因座开始的重叠峰也相应消失了（图1D）。这些发现证实，用Cas9-GFP/sgRNA共表达载体和ssODN共转染可以纠正HCT-116细胞中的β-cateninΔTCTser45缺失突变。

图2:β-cateninΔTCTser45突变校正的功能作用

β-catenin的Ser45是重要的磷酸化位点。ΔTCT密码子的缺失突变将对HCT-116细胞中的β-cateninSer45磷酸化产生巨大影响。因此，研究人员研究了缺失突变体和被校正突变体中β-catenin的表达水平。如预期的那样，与没有β-cateninΔTCT缺失突变的DLD1大肠癌细胞相比，未校正的HCT-116细胞具有非常弱的可检测Ser45磷酸化β-catenin表达（图2A）。他们还研究了对照组和一个突变校正的HCT-116细胞克隆中的蛋白质表达，即总体、核和细胞质的β-catenin水平（图2B）。此外，他们还比较了蛋白质的表达以及E-cadherin（E-钙粘蛋白），c-myc，cyclinD1和survivin基因（图2C，D，E和F）。

文章来源：《肿瘤药学》 网址: http://www.zlyxzz.cn/zonghexinwen/2021/0708/1440.html